|
|
Practical aspects of single-cell RT-qPCR analysis
Žucha, Daniel ; Valihrach, Lukáš (vedoucí práce) ; Pavlínková, Gabriela (oponent)
Prelomové objavy spojené s kvantifikáciou RNA z jednotlivých buniek menia aktuálny pohľad na biológiu a medicínu. Vhodnou metódou pre ich analýzu je modifikovateľná a vysoko senzitívna metóda reverznej transkripcie a kvantitatívnej PCR (RT-qPCR), ktorej limitácie však neboli doposiaľ plne preskúmané v kontexte tak nízkych množstiev vstupného materiálu. Táto práca sa zameriava na objasnenie vplyvu rôznorodých faktorov, ktoré by mohli ovplyvniť správnosť fungovania RT-qPCR, zahrňujúc podmienky pre zber vzoriek a ich spracovanie, kontroly kvality, výkonnosť reverznej transkripcie, preamplifikácie a rolu qPCR esejí. Naše výsledky ukazujú, že predĺžené časy pri zbere buniek ako aj opakované zmrazovanie a rozmrazovanie vzoriek malo zanedbateľný dopad na kvalitu RT-qPCR dát. Priama lýza buniek, bežne využívaná pri extrakcii RNA z jednotlivých buniek, je taktiež vhodná pre vzorky obsahujúce až 256 buniek. Porovnanie 11 revererzných transkriptáz s minimálnym množstvom vstupného materiálu identifikovalo 2 enzýmy s nadštandardným výkonom. Zníženie reakčného objemu preamplifikácie či neoptimálny dizajn primerov viedol k zníženiu senzitivity reakcie. Na záver bola optimalizovaná RT-qPCR použitá k profilovaniu génovej expresie astrocytov v myšom modeli amyotrofickej laterálnej sklerózy (ALS), ktorou sme...
|
host ::
RSS.